Diagnostics

 

Roche Diagnostics desarrolla y comercializa los tests más innovadores basados en la tecnología de la Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR), premiada con un premio Nobel.  La PCR es una técnica de biología molecular que permite la rápida replicación del ADN. Con la PCR, cantidades mínimas de material genético pueden ser amplificadas millones de veces en pocas horas permitiendo la detección rápida y fiable de los marcadores genéticos de enfermedades infecciosas, cáncer y desórdenes genéticos.

El uso de la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa ha aumentado mucho la capacidad de los científicos para estudiar el material genético. Desde su invención por científicos de Cetus Corporation en 1983, la PCR ha cambiado la forma en la que se lleva a cabo la investigación y diagnóstico médico. La capacidad de producir rápidamente grandes cantidades de material genético ha permitido avances científicos significativos, incluyendo huella dactilar del ADN y la secuenciación el genoma humano. Además, la tecnología PCR ha influido mucho en los campos del diagnostico de la enfermedad y manejo del paciente, particularmente en las áreas de SIDA y hepatitis C.

 

¿Cuáles son los pasos en PCR?

  • La PCR está diseñada según el principio natural de replicación del ADN. Es un proceso de tres pasos, designado como un ciclo, que se repite un número específico de veces.
  • Un ciclo de PCR consiste en los siguientes pasos:
       1. Desnaturalización
       2. Alineación
       3. Extensión
  • Este proceso tiene lugar en un termociclador, un instrumento que automáticamente controla y alterna las temperaturas durante períodos programados de tiempo para el número apropiado de ciclos de PCR (generalmente entre 30 y 40 ciclos).

Paso 1º PCR: Desnaturalización por calor.

  • El calor (generalmente > 90°C) separa la doble hebra de ADN en dos filamentos, esto se conoce como “desnaturalización".

Puesto que los enlaces del hidrógeno que unen las bases de uno a otro son débiles, se rompen a altas temperaturas, mientras que los enlaces entre fosfatos y desoxirribosa, que son enlaces covalentes más fuertes, permanecen intactos.

Paso  PCR: Alineación – unión de la sonda a la secuencia diana.

  • El objetivo no es replicar la hebra entera de ADN sino replicar la secuencia diana de aproximadamente 100-600 pares de bases que es única en el organismo.
  • Los iniciadores marcan el final de la secuencia diana: éstos son sintéticos y cortos, creados a partir de una hebra única de ADN y que normalmente constan de 20-30 bases, con una marca de biotina 5’ al final para ayudar a la detección.
  • Two primers are included in the PCR, one for each of the complementary single DNA strands that was produced during denaturation. The beginning of the DNA target sequence of interest is marked by the primers that anneal (bind) to the complementary sequence.
  • Temperatura de Alineación: generalmente ocurre entre 40°C y 65°C, dependiendo de la longitud y la secuencia de bases de los iniciadores. Permite que éstos se unan a la secuencia diana con alta especificidad.

Paso 3º PCR: Extensión

  • Una vez que los iniciadores se han unido a las secuencias complementarias de ADN, la temperatura se eleva aproximadamente a 72°C y la enzima Taq polimerasa replica los filamentos de ADN.
  • La Taq ADN polimerasa es una ADN polimerasa recombinante termoestable del organismo Thermus aquaticus, que a diferencia de otras polimerasas se mantiene activa a elevada temperatura. Comienza el proceso de síntesis en la región marcada por los iniciadores y sintetiza una nueva hélice de ADN de doble hebra, ambas idénticas al original, para facilitar la unión de los nucleótidos complementarios que quedan libres en la solución (dNTPs).
  • La extensión comienza siempre en el extremo 3' del iniciador creando una doble tira a partir de cada una de las hebras individuales. La Taq ADN polimerasa sintetiza exclusivamente en la dirección 5’ a 3’. No obstante los nucleótidos libres en la solución sólo se añaden al extremo 3`del iniciador, construyendo la tira complementaria de la secuencia de ADN.


Final del primer ciclo de PCR

  • Al final del primer ciclo de PCR, nos encontramos dos nuevas tiras de ADN idénticas al original.
  • Punto final: La ADN polimerasa no reconoce el final de la secuencia. Las nuevas hebras formadas tienen un principio, definido precisamente por el extremo 5’ del iniciador, aunque el extremo 3' no queda definido.
  • Mientras que el número de ciclos aumenta, una hebra con una longitud más definida sirve como plantilla para la nueva secuencia sintetizada.
  • La hebra de ADN sintetizada a partir esta plantilla tiene una longitud definida que está limitada por el extremo 5’ de cada uno de los dos iniciadores. Estas hebras de ADN se denominan AMPLICONES.
  • Después de algunos ciclos, las hebras de DNA que corresponden a la secuencia diana, están presentes en un número mucho mayor que las secuencias de longitud variable.
  • En otras palabras la secuencia flanqueada o definida por los dos iniciadores es la sección que se amplifica.

Paso 2º PCR: Alineación – unión de la sonda a la secuencia diana.

  • El objetivo no es replicar la hebra entera de ADN sino replicar la secuencia diana de aproximadamente 100-600 pares de bases que es única en el organismo.
  • Los iniciadores marcan el final de la secuencia diana: éstos son sintéticos y cortos, creados a partir de una hebra única de ADN y que normalmente constan de 20-30 bases, con una marca de biotina 5’ al final para ayudar a la detección.
  • Two primers are included in the PCR, one for each of the complementary single DNA strands that was produced during denaturation. The beginning of the DNA target sequence of interest is marked by the primers that anneal (bind) to the complementary sequence.
  • Temperatura de Alineación: generalmente ocurre entre 40°C y 65°C, dependiendo de la longitud y la secuencia de bases de los iniciadores. Permite que éstos se unan a la secuencia diana con alta especificidad.


Paso 3º PCR: Extensión

  • Una vez que los iniciadores se han unido a las secuencias complementarias de ADN, la temperatura se eleva aproximadamente a 72°C y la enzima Taq polimerasa replica los filamentos de ADN.
  • La Taq ADN polimerasa es una ADN polimerasa recombinante termoestable del organismo Thermus aquaticus, que a diferencia de otras polimerasas se mantiene activa a elevada temperatura. Comienza el proceso de síntesis en la región marcada por los iniciadores y sintetiza una nueva hélice de ADN de doble hebra, ambas idénticas al original, para facilitar la unión de los nucleótidos complementarios que quedan libres en la solución (dNTPs).
  • La extensión comienza siempre en el extremo 3' del iniciador creando una doble tira a partir de cada una de las hebras individuales. La Taq ADN polimerasa sintetiza exclusivamente en la dirección 5’ a 3’. No obstante los nucleótidos libres en la solución sólo se añaden al extremo 3`del iniciador, construyendo la tira complementaria de la secuencia de ADN.


Final del primer ciclo de PCR

  • Al final del primer ciclo de PCR, nos encontramos dos nuevas tiras de ADN idénticas al original.
  • Punto final: La ADN polimerasa no reconoce el final de la secuencia. Las nuevas hebras formadas tienen un principio, definido precisamente por el extremo 5’ del iniciador, aunque el extremo 3' no queda definido.
  • Mientras que el número de ciclos aumenta, una hebra con una longitud más definida sirve como plantilla para la nueva secuencia sintetizada.
  • La hebra de ADN sintetizada a partir esta plantilla tiene una longitud definida que está limitada por el extremo 5’ de cada uno de los dos iniciadores. Estas hebras de ADN se denominan AMPLICONES.
  • Después de algunos ciclos, las hebras de DNA que corresponden a la secuencia diana, están presentes en un número mucho mayor que las secuencias de longitud variable.
  • En otras palabras la secuencia flanqueada o definida por los dos iniciadores es la sección que se amplifica.